Optimalisatie van handige realtime PCR-machines

Als het realtime fluorescentiekwantitatieve PCR is voor viruskwantificatie en SNP-genotypering, hebben we een PCR-machine nodig met de hoogst mogelijke specificiteit; Als het ziekteverwekker en mRNA -detectie is, hebben we een hoge gevoeligheid nodig PCR -machine, dus hoe moeten we deze PCR -machine optimaliseren?

Hier is de inhoudslijst:

l Verbetering van de efficiëntie van PCR -machines

l Gebruik van realtime PCR-machine-primers voor algemene PCR

Verbetering van de efficiëntie van PCR -machines

Verbeteren de PCR -machine Versterkingsefficiëntie, specificiteit en gevoeligheid, we kunnen de real-time fluorescentiekwantitatieve PCR-machine voor het experiment optimaliseren via een reeks maatregelen. De eerste is de selectie van de doelsequentie.

1, de keuze van de handige real-time PCR-machine-doelsequentie geschikte lengte tussen 50 en 150 bp. Kortere sequenties hebben minder tijd nodig om te synthetiseren en hebben kortere versterkingstijden, dus de mogelijkheid om DNA te besmetten wordt verminderd.

2 Gebruik bij het selecteren van de doelsequentie Blast -zoekopdracht om de doelsequentie voor polymorfismen en sequentiefouten te analyseren en te vermijden. Als er dubbele sequenties in de doelsequentie zijn, vermindert dit de detectiegevoeligheid van deze PCR -machine en moet ook worden vermeden.

3, regelt het GC -gehalte ≤ 60% in de doelsequentie. Hoog GC-gehalte heeft invloed op de denaturatie van de doelsequentie in de thermische cyclus, maar ook gemakkelijk om deze PCR-machine niet-specifieke versterking te produceren.

4, vermijd het genereren van secundaire structuur. Doelsequenties met omgekeerde repetitieve sequenties zijn eenvoudig om secundaire structuur te produceren, die de hybridisatie van handige realtime PCR-machine-primers en sondes beïnvloeden.

Daarnaast moeten we er ook voor zorgen dat de kwaliteit van de sjabloon geen invloed heeft op de versterking, de resultaten van de handige realtime PCR-machine hebben betrouwbaarheid. Beschadigd DNA kan bijvoorbeeld niet voldoende worden geamplificeerd in de PCR -machine, of helemaal niet worden versterkt. Ook kan de aanwezigheid van DNA -polymerase -remmende reagentia (DMSO, enz.) En verontreinigingen (SDS, enz.) In de sjabloon de betrouwbaarheid van de PCR -machine -amplificatieresultaten beïnvloeden.

Gebruik van realtime PCR-machine-primers voor algemene PCR

Krijg handige realtime PCR -machine Primers, deze methode kan ook worden gebruikt voor gewone PCR.

1, de lengte moet 18-30 bp zijn om de specificiteit van binding te waarborgen.

2, de smelttemperatuur (TM-waarde) moet 55-60 ° C zijn en de TM-waarden van de twee primers moeten verschillen met 2-3 ° C.

3, elke primer moet aan het 3 'uiteinde 1 tot 3 guanines of cytosines hebben, wat de niet-specifieke versterking tijdens de PCR-machine gemakkelijk in realtime kan verminderen. Meer dan 3 zullen averechts werken en een "glijdend effect " veroorzaken die leidt tot de verkeerde extensie.

4. Het GC -gehalte van de primers moet ongeveer 50%zijn, een te hoog GC -gehalte zal de TM -waarde verhogen.

5, De PCR -machine -primers moeten omgekeerde repetitieve sequenties vermijden, omdat deze een secundaire structuur zal vormen, die de primerbinding op de sjabloon beïnvloedt.

6, als het RT-PCR is, moet u ook voorkomen dat primers ontwerpen om te binden aan exonsequenties, wat zal leiden tot vals-positieve PCR-machine-experimentele resultaten. De juiste aanpak moet worden ontworpen op de lange intronflank, of korte introns, of over de exon-exon junction-regio.

7. De primers ontzouten en zuiveren.

Merk op dat soms, wanneer u alle punten hebt gedaan, de primers niet kunnen versterken, dus u moet de primers opnieuw ontwerpen.

Bioteke focust op snelle nucleïnezuurdetectie en POCT -snelle detectie en biedt soorten laboratoriuminstrumenten als: virusbemonsteringsverzameling, automatische nucleïnezuur -extractor, PCR -machine en desinfecterende apparaten. En het biedt ook vele soorten reagentia en kits.